Групповые фосфатазные изоферменты

Групповые фосфатазные изоферменты

Крахмального геля помещают в соответствующую кювету и заливают приблизительно 50 мл раствора фенолфталеиндифосфата (состав раствора: 6,4 г фенолфталеиндифосфата+ электродного буфера-440 мл дистиллированной воды). Инкубация геля проходит в термостате при 37 °С в течение 2—3 ч. После этого в инкубационную среду добавляют несколько капель аммиака, в результате чего наступает подщелачивание (алкализация) раствора и в местах расположения электрофоретически разделенных изоферментов КЭФ выделяется свободный фенолфталеин, окрашивающий групповые фосфатазные изоферменты в красный цвет. Кроме того, алкализация инкубационного раствора подавляет ферментативную активность КЭФ, вследствие чего дальнейшее расщепление ею субстрата фенолфталеиндифосфата не происходит. Другой способ выявления ферментативной активности КЭФ — использование флюорогенного субстрата 4-метилумбеллиферилфосфата.

Другой способ выявления ферментативной активности КЭФ — использование флюорогенного субстрата 4-метилумбеллиферилфосфата. Для этого 3 мг субстрата растворяют в 8 мл нитратного буфера с величиной pH в пределах 4,8—6,0. Раствором смачивают лист фильтровальной бумаги, который накладывают на поверхность разрезанного геля, добиваясь устранения возможно образовавшихся пузырьков воздуха. Инкубацию проводят в термостате при 37 °С в течение 10 мин. После этого бумагу удаляют и гель облучают длинноволновыми ультрафиолетовыми лучами, при этом в местах расположения групповых изоферментов КЭФ наблюдается светло-голубая флюоресценция освободившегося в результате расщепления субстрата 4-метилумбеллиферона.

При работе со старыми гемолизатами эритроцитов крови или вытяжками из пятен крови обычно увеличивают срок инкубации геля с раствором субстрата.

Оставить комментарий

Почта (не публикуется) Обязательные поля помечены *

Вы можете использовать эти HTML теги и атрибуты: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <strike> <strong>

Подтвердите, что Вы не бот — выберите самый большой кружок: