Комбинированные методы выявления групповых изоферментов

Комбинированные методы выявления групповых изоферментов

Оригинальная методика R A Fildes, С. W Parr (1963) в дальнейшем подвергалась многочисленным модификациям. Кроме того, были разработаны комбинированные методы выявления групповых изоферментов 6-ФГД и групповых пзоферментов других генетически детерминированных ферментных систем в одном гелевом блоке Brinkmann, Thoma, 1970; Smerling 1971. Мы подробно описываем технику определения фенотипов 6-ФГД по Q. Radam, Н Strauch (1971), которая дает хорошие результаты электрофоретического разделения ее групповых изоферментов. Radam, Н Strauch (1971), которая дает хорошие результаты электрофоретического разделения ее групповых изоферментов. Горизонтальный электрофорез в крахмальном геле: электродный буфер — 0,1 М цитратный буфер, pH 6,0; . гелевый буфер — 0,002 М цитратный буфер, pH 6,0. Для внесения гемолизатов эритроцитов в гель крахмала используются кусочки фильтровальной бумаги фирмы Шлейхер и Шюлль № 2043b.

Электрофорез проводят при градиенте напряжения 8,5 В/см. Продолжительность электрофореза 5 ч в условиях холодильника. Метод выявления ферментативной активности 6-ФГД: используют способ агаровой аппликации. Для этого 100 мг агара растворяют в 20 мл 0,1 М трис-HCl буфера, pH 8,0, и кипятят на водяной бане в течение 30 мин до полного расплавления зерен агара. После охлаждения агарового раствора до 40 °С в него добавляют: 20 мг 6-фосфоглюконата (6-ФГ), 4 мг никотинамидадениндинуклеотидфосфата (NADP), 1 мг феназинметасульфата (ФМС) и 4 мг 3(4,5-диметилтиозолил-2)-2,5-дифенилтетразолиумбромид (МТТ). Продолжительность агаровой аппликации 20 мин в термостате при 37 °С, после чего проводится учет результатов реакции.

Принцип реакции: 6-ФГД переводит 6-фосфоглюконат (6-ФГ) в рибулозо-5фосфат путем восстановления (редукции) NADP.

Оставить комментарий

Почта (не публикуется) Обязательные поля помечены *

Вы можете использовать эти HTML теги и атрибуты: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <strike> <strong>

Подтвердите, что Вы не бот — выберите самый большой кружок: