Выявление ферментативной активности КЭФ

Выявление ферментативной активности КЭФ

Метод электрофореза в тонком слое агарозного геля (Radam, Strauch, 1985; модифицированная техника методики Marlin, Voss, 1978 (рис. 15) Основной буфер: трис-цитратфосфатный буфер (pH 6,77) +22,05 г тринатрийцитрата2Н20, 6,00 г трис и 0,93 г хелаплекс III, доводят до объема 1000 мл дистиллированной водой (величину pH устанавливают с помощью едкого натра). Электродный буфер: 100 мл основного буфера+400 мл дистиллированной воды. В анодную и катодную камеру прибора для электрофореза добавляют по 250 мл электродного буфера. Агарозный гель: 600 мл агарозы SERVA № И 397 растворяют в 15 мл электродного буфера и 45 мл дистиллированной воды и заливают на стеклянную пластинку размером 20×20 см. После образования желеобразного геля пластинку помещают на 1 ч в холодильник. Агарозный гель: 600 мл агарозы SERVA № И 397 растворяют в 15 мл электродного буфера и 45 мл дистиллированной воды и заливают на стеклянную пластинку размером 20×20 см. После образования желеобразного геля пластинку помещают на 1 ч в холодильник.

Прививка образцов: в агарозном геле с помощью покровных стекол делают перфорированные отверстия (стартовые лунки), которые могут располагатьсяв три ряда (3, 9 и 15 см от катодного края пластинки). Отверстия заполняют освобожденными от эритроцитарной стромы гемолизатами с помощью капилляров или микропипеток. Мостиками, соединяющими электродный буфер с гелем агарозы, служат листки фильтровальной бумаги фирмы Шлейхер и Шюлль № 1753, которую можно использовать несколько раз. Продолжительность электрофореза 75 мин при стабилизированном напря197 жении на клеммах 600 В при обязательном проточном водном охлаждении подставки до температуры 10°С. Выявление ферментативной активности КЭФ проводят с помощью флюорогенного субстрата 4-метилумбеллиферилфосфата.

Оставить комментарий

Почта (не публикуется) Обязательные поля помечены *

Вы можете использовать эти HTML теги и атрибуты: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <strike> <strong>

Подтвердите, что Вы не бот — выберите самый большой кружок: